Javascript è attualmente disabilitato nel tuo browser.Diverse funzionalità di questo sito non funzioneranno mentre javascript è disabilitato.accesso aperto alla ricerca scientifica e medicaDalla presentazione alla prima decisione editoriale.Dall'accettazione editoriale alla pubblicazione.La suddetta percentuale di manoscritti è stata respinta negli ultimi 12 mesi.Riviste scientifiche e mediche peer-reviewed ad accesso libero.Dove Medical Press è membro dell'OAI.Ristampe in blocco per l'industria farmaceutica.Offriamo vantaggi reali ai nostri autori, inclusa l'elaborazione accelerata degli articoli.Registra i tuoi dettagli specifici e farmaci specifici di interesse e abbineremo le informazioni fornite agli articoli dal nostro ampio database e ti invieremo prontamente copie PDF via e-mail.Torna a Diari » Rivista Internazionale di Nanomedicina » Volume 13Autori Jin X, Yang Q, Cai NPubblicato il 3 luglio 2018 Volume 2018:13 Pagine 3827—3838DOI https://doi.org/10.2147/IJN.S167529Revisione da parte di Single anonimo peer reviewEditore che ha approvato la pubblicazione: Dr Linlin SunXin Jin, Qing Yang, Dipartimento di farmacia ospedaliera di Ning Cai, Ospedale della provincia di Jiangsu, filiale di Suqian, Suqian 223800, Cina Introduzione: Il composto di ginsenoside K (CK) ha effetti sulla regolazione del ciclo cellulare, sull'inibizione della crescita tumorale e sull'induzione dell'apoptosi.Tuttavia, ha applicazioni limitate in ambito clinico a causa della sua bassa solubilità e del suo scarso assorbimento.Metodi: Per superare queste limitazioni, abbiamo mirato a sviluppare un sistema micellare misto composto da fosfatidilcolina (PC) e 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina polietilenglicole 2000 (DSPE PEG 2000; DP).Il CK incapsulato in micelle miste PC/DP ha migliorato la solubilità, la permeabilità e gli effetti di ritenzione.RISULTATI: Rispetto al CK libero, il sistema micellare CK PC/DP ha mostrato effetti antitumorali migliorati in vitro, inclusi arresto del ciclo cellulare, apoptosi e anti-invasione nelle cellule A549 di carcinoma polmonare umano.Il significativo effetto proapoptotico è stato riflesso da una maggiore condensazione cromosomica, colorazione con annessina V/ioduro di propidio e relativa espressione proteica.L'assorbimento cellulare in vitro e l'imaging ottico del topo in vivo hanno suggerito che il miglioramento dell'effetto antitumorale era causato principalmente da un maggiore assorbimento e dal targeting del tumore.Inoltre, uno studio di efficacia antitumorale in vivo ha indicato che le micelle miste CK inibivano significativamente la crescita del tumore, diminuendo così il volume del tumore alla fine dell'esperimento rispetto a quello dei topi di controllo.L'analisi istologica ha confermato l'effetto antitumorale con bassa tossicità.Conclusione: il sistema micellare PC/DP era un efficace sistema di somministrazione di farmaci per la CK nella terapia del tumore.Parole chiave: sistema micellare misto, composto ginsenoside-K, effetto mirato, antitumorale, cancro ai polmoniIl Panax ginseng CA Meyer è una delle medicine tradizionali cinesi più popolari e i ginsenosidi sono i suoi principali componenti attivi.Il composto K (CK) è stato trovato per la prima volta negli idrolizzati batterici del suolo di ginsenosidi nel 1972.1 Sebbene la sua struttura fosse stata identificata a quel punto, la CK non è stata considerata seriamente fino all'inizio del 1996, quando le vie metabolizzanti specifiche nella conversione dei ginsenosidi in CK da parte della flora intestinale sono stati determinati.2 I ginsenosidi sono scarsamente assorbiti dall'intestino, ma il loro metabolita, CK, viene assorbito.3 Numerose revisioni hanno indicato che l'attività antitumorale dei ginsenosidi è inversamente correlata al numero di gruppi zuccherini che possiedono.4,5 CK, con un solo gruppo glucopiranosile, è spesso considerato il componente più attivo del ginseng.6 Ha effetti notevoli sulla regolazione del ciclo cellulare,7 inibizione della crescita tumorale,8 induzione dell'apoptosi,9,10 inibizione dell'invasione delle cellule tumorali e metastasi .11 Tuttavia, la sua scarsa solubilità in acqua e il significativo efflusso di glicoproteina P ne hanno limitato l'uso nei disturbi umani a causa della bassa biodisponibilità orale.12–14Numerosi vettori di somministrazione di farmaci - come coniugati polimero-farmaco, micelle, nanoparticelle e liposomi stealth - sono stati studiati per un'efficace somministrazione di farmaci.15-17 Per quanto ne sappiamo, solo coniugati di polietilenglicole-CK, glicole idrofilo chitosano-CK coniugati, D-α-tocoferil polietilenglicole 1000 liposomi modificati con succinato e ascorbil palmitato/D-α-tocoferil polietilenglicole 1000 micelle miste di monoestere succinato sono stati progettati per migliorare l'efficacia di CK.18,19 Nei nostri studi precedenti, CK incapsulato all'interno di portatori di farmaci di dimensioni nanometriche aveva una migliore efficacia farmacologica rispetto a quella del CK libero.20,21 A causa delle loro interessanti caratteristiche di caricamento del farmaco, i sistemi micellari possono aumentare significativamente la solubilità dei farmaci idrofobici.22,23 Tuttavia, le grandi dimensioni delle particelle e la bassa stabilità limitano l'applicazione di micelle polimeriche singole,24 che vengono gradualmente sostituite da micelle miste binarie.Micelle miste con piccole dimensioni delle particelle e stabilità migliorata potrebbero superare gli inconvenienti delle singole micelle polimeriche attraverso gli effetti sinergici di diversi eccipienti.25,26 Pertanto, sono stati scelti sistemi di micelle miste per ulteriori studi.La fosfatidilcolina (PC) e l'1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina polietilenglicole 2000 (DSPE PEG 2000; DP) sono stati ampiamente utilizzati come eccipienti farmaceutici a causa della loro comprovata sicurezza.27–31 Alte concentrazioni di DP possono solubilizzare farmaci in larga misura.Il PC può regolare gli aggregati del segmento idrofobico per formare un nucleo interno stabile per promuovere la sistemazione dei farmaci tramite interazioni idrofobiche.Questo semplice approccio di combinazione di migliore solubilità e stabilità forma il sistema micellare misto.Inoltre, il guscio idrofilo – che comprende PEG 2000 in DP – potrebbe dotare sistemi micellari misti con lunghi tempi di circolazione e targeting passivo della posizione del tumore.32,33 Pertanto, potrebbe essere un sistema di rilascio del farmaco ideale per la somministrazione endovenosa di CK (Figura 1).Figura 1 Illustrazioni di micelle miste a base di composto K di ginsenoside e loro modalità d'azione per una maggiore efficacia antitumorale.Abbreviaiton: Casp, caspase.Per migliorare l'effetto antitumorale di CK e consentirne l'iniezione, sono state preparate micelle miste PC/DP caricate con CK.La linea cellulare di adenocarcinoma polmonare umano, A549, è stata scelta per studiare gli effetti antitumorali in vitro e in vivo.Nel frattempo, l'assorbimento e gli effetti tumorali mirati sono stati confermati dall'analisi dell'assorbimento cellulare in vitro e dall'imaging ottico del topo in vivo.Il ginsenoside CK è stato ottenuto da Xi'an XiaoCao Botanical Development Co., Ltd. Sia PC che DP sono stati acquistati da Shanghai Advanced Vehicle Technology Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai, Cina.Cumarin-6, 1,1′-diottadecil-3,3,3′,3′-tetrametilindotricarbocianina ioduro (DiR) e 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) sono stati acquistati da Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co. Ltd, Shanghai, Cina.Cellule A549, terreno di coltura RPMI 1640, siero bovino fetale, nonché anti-caspasi 3, anti-caspasi 8, anti-caspasi 9, anti-poli ADP-ribosio polimerasi (anti-PARP), anti-Bax e anti- Gli anticorpi Bcl-2 sono stati ottenuti da Jiangsu Keygen Biotech Corp., Ltd., Nanchino, Cina.I topi nudi sono stati acquistati da Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd., Shanghai, Cina.Gli altri solventi utilizzati erano di grado cromatografico.I topi maschi nudi sono stati acquistati dallo SLEK Lab Animal Center di Shanghai (Shanghai, Cina) e hanno ricevuto cure secondo le Linee guida sull'uso degli animali da laboratorio.Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con i principi della cura e dell'uso degli animali da laboratorio e sono stati approvati dal comitato amministrativo degli animali sperimentali del Suqian Branch Jiangsu Province Hospital.L'approvazione etica e legale è stata ottenuta prima dello studio.Preparazione di sistemi micellari CK PC/DPI sistemi micellari CK PC/DP sono stati preparati con la tecnica di idratazione a film sottile.In breve, CK, PC e DP (rapporto molare = 5:18:12) sono stati accuratamente pesati e completamente disciolti in cloroformio.Il cloroformio è stato rimosso mediante evaporazione rotativa a 100 rpm per 20 minuti a 40°C fino a quando nel pallone rotondo non si è formata una pellicola sottile.Questo film è stato idratato a 50 rpm utilizzando un bilanciere da tavolo a pressione normale per 1 ora a 40°C per ottenere i sistemi micellari CK PC/DP grossolani.Infine, i sistemi micellari CK PC/DP grossolani sono stati dispersi a 25°C in un bagno sonicatore a 45 W per 30 minuti per ridurre la dimensione delle particelle e formare un sistema omogeneo.Le micelle miste cumarina-6 e le micelle miste DiR sono state preparate utilizzando il metodo sopra menzionato sostituendo CK con cumarina-6 e DiR ad un rapporto specificato di PC e DP (rapporto molare = 18:12), rispettivamente.Caratterizzazione di sistemi micellari CK PC/DPLa distribuzione dimensionale e il potenziale ζ dei sistemi micellari CK PC/DP sono stati misurati utilizzando uno strumento dinamico di diffusione della luce (Zetasizer Nano ZSP, Malvern Instruments, Malvern, Worcestershire, Regno Unito).Dopo essere stati diluiti 10 volte, i campioni sono stati misurati a 25°C in triplicato in acqua deionizzata.Le caratteristiche morfologiche delle micelle miste CK sono state fotografate con un microscopio elettronico a trasmissione (TEM; JEOL, Tokyo, Giappone).Dopo essere stati diluiti 10 volte con acqua distillata, i campioni sono stati posti su una griglia di rame ricoperta di pellicola di carbone e quindi sono stati asciugati all'aria.Successivamente, i campioni sono stati colorati con acido fosfotungstico al 2% per 3 minuti e asciugati all'aria prima dell'osservazione.Gli approcci classici per misurare la solubilità si basavano sul metodo di saturazione shake-flask.Le quantità in eccesso di CK sono state poste in fiale da 5 mL contenenti soluzioni acquose.Le fiale sono state sigillate e poste in un bagno a temperatura costante (37°C) e agitate per 24 h fino a quando l'equilibrio era evidente.Dopo la centrifugazione delle sospensioni incubate a 37°C e 15.000 rpm per 15 minuti, le concentrazioni di CK nelle soluzioni surnatanti sono state determinate mediante una procedura di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).Inoltre, la concentrazione di CK nel sistema micellare è stata determinata dopo una diluizione da 10 a 100 volte con metanolo e quindi analizzata per CK.Il rilascio del farmaco in vitro è stato studiato con il metodo di dialisi utilizzando una membrana di dialisi con un cutoff di peso molecolare di 3,5 kDa.La soluzione micellare mista CK, o CK libero ad una concentrazione di CK equivalente, è stata posta nella sacca per dialisi.Quindi, è stato immerso in mezzo di rilascio (acqua deionizzata) e incubato a 37°C con agitazione continua a 100 rpm.A 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 36 e 48 h, è stato campionato 1 mL del dializzato e il volume del mezzo di rilascio è stato reintegrato con acqua deionizzata.Il dialisato campionato è stato filtrato attraverso una membrana da 0,45 μm e analizzato mediante HPLC.Quindi, sono state calcolate le curve di rilascio CK.Le cellule A549 sono state seminate in piastre da 96 pozzetti e trattate con micelle miste CK o CK a diverse concentrazioni.Dopo un trattamento di 24 ore, i farmaci sono stati sostituiti con un mezzo di coltura in bianco con bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) e incubati per 4 ore a 37°C.Quindi, le piastre sono state agitate per 10 minuti a 3.000 giri al minuto.Infine, il mezzo è stato sostituito con 100 μL di dimetilsolfossido (DMSO) per dissolvere i cristalli di formazano prodotti.L'assorbanza è stata misurata in uno spettrofotometro a scansione multi-lunghezza d'onda (Modello 680, Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) a 570 e 630 nm.Le cellule (1 × 106 cellule/mL) sono state seminate in piastre a sei pozzetti e coltivate per 24 ore.Quindi, sono stati trattati con micelle miste CK o CK per 24 ore a 12,15 μg/mL.Le cellule sono state lavate con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e raccolte con acido tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA).Le cellule raccolte sono state contate e fissate con etanolo al 70%.I campioni sono stati risospesi in 1,0 mL di soluzione di ioduro di propidio ipotonico (PI) e incubati al buio per 30 minuti a 4°C.I campioni colorati con PI sono stati analizzati con un citometro a flusso (Beckman Coulter, USA).Le cellule A549 sono state seminate in una piastra da 12 pozzetti e lasciate crescere fino alla confluenza.Una punta di pipetta da 200 μL è stata utilizzata per graffiare una linea nel monostrato cellulare.Le cellule sono state lavate con PBS tre volte per rimuovere le cellule galleggianti e le cellule aderenti sono state coltivate per altre 24 ore con un mezzo privo di siero contenente micelle miste CK o CK a 12,15 μg/mL.Le cellule in coltura sono state fotografate ed è stata misurata la larghezza della ferita da graffio.L'apoptosi cellulare è stata analizzata qualitativamente mediante etichettatura terminale del nick-end dUTP mediata da deossinucleotidil transferasi (TUNEL).In breve, dopo il trattamento con micelle miste CK o CK, le cellule A549 fissate in formalina (2 × 105 cellule/mL) sono state permeabilizzate usando Triton X-100 a 4°C per 5 min.Le cellule sono state lavate ed etichettate con la miscela di reazione TUNEL per 60 minuti a 37°C al buio.Il DNA frammentato era colorato di marrone.Le cellule sono state fotografate utilizzando un microscopio ottico.Per l'analisi quantitativa, l'apoptosi cellulare è stata determinata mediante citometria a flusso.Le cellule A549 sono state trattate con terreno di coltura in bianco, micelle miste CK o CK (12,15 μg/mL) per 24 ore.Dopo due lavaggi con PBS ghiacciato, le cellule sono state raccolte con tripsina-EDTA e risospese a 1 × 106 cellule/mL.Le sospensioni cellulari (100 μL) sono state mantenute al buio e colorate contemporaneamente con FITC-annessina V (FITC-AV) e PI per 10 minuti a 37°C;successivamente, l'apoptosi è stata analizzata mediante citometria a flusso.L'assorbimento cellulare è stato valutato mediante imaging a fluorescenza.La cumarina-6 è stata scelta come sonda fluorescente perché è un substrato per la glicoproteina P, simile alla CK.Le cellule A549 sono state seminate in piastre da 24 pozzetti e incubate per 24 ore.Successivamente, il mezzo contenente micelle miste di cumarina-6 o soluzione di cumarina-6 è stato aggiunto in ciascun pozzetto e incubato a 37°C per 4 ore.Successivamente, le cellule sono state fissate con formaldeide al 4% per 10 minuti.Le cellule sono state quindi colorate con DAPI per 10 minuti al buio.Queste cellule sono state quindi lavate con PBS due volte e osservate al microscopio a fluorescenza (IX71; Olympus Corp, Tokyo, Giappone) e al microscopio confocale a scansione laser (TCS SP5; Leica, Heidelberg, Germania).Le micelle miste caricate con DiR sono state utilizzate per studiare l'efficacia del targeting del tumore nel modello di tumore allo xenotrapianto di cellule A549.Quando il volume del tumore ha raggiunto ~ 400 mm3, i topi sono stati iniettati con micelle miste DiR o DiR attraverso la vena della coda alla dose di 5 mg/kg.L'intensità della fluorescenza è stata visualizzata utilizzando il sistema di imaging a fluorescenza in vivo Maestro EX (Cambridge Research & Instrumentation Inc. [CRi], Woburn, MA, USA).Dopo l'imaging in vivo, i topi sono stati sottoposti a eutanasia a 24 ore e gli organi principali, come cuore, fegato, milza, polmoni e reni, nonché i tumori, sono stati asportati.Sono state misurate le intensità del segnale di fluorescenza nel vicino infrarosso in questi tessuti asportati.Efficacia antitumorale in vivo di micelle misteLe cellule A549 sono state impiantate per via sottocutanea in ciascun fianco di topi nudi.Una volta che gli xenotrapianti A549 hanno raggiunto 50 mm3, i topi sono stati randomizzati in tre gruppi di trattamento (cinque topi per gruppo): gruppo di controllo non trattato, gruppo CK libero e gruppo di micelle miste CK.I topi sono stati trattati con dosi equivalenti di micelle miste CK di 30 mg/kg di CK libero ogni 3 giorni per 12 giorni consecutivi tramite iniezione nella vena della coda.Il quindicesimo giorno, i topi sono stati sottoposti a eutanasia per rimuovere fegato, reni e tumori.Questi tessuti sono stati colorati con ematossilina ed eosina (H&E) per l'analisi patologica.I lisati delle cellule tumorali (25 μg) sono stati separati mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) e trasferiti su membrane di polivinilidene difluoruro.Le membrane sono state incubate con anticorpi primari specifici a 4°C per 12 ore e visualizzate utilizzando un sistema di rilevamento Western blotting.Gli anticorpi Caspase-3, caspase-8, caspase-9, PARP, Bax e Bcl-2 sono stati ottenuti da Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA).I risultati del Western blotting sono stati analizzati sulla base del livello di chemiluminescenza.La concentrazione di CK è stata determinata mediante HPLC su un Agilent 1200 (Agilent Co. Ltd, Waldbronn, Germania) dotato di una colonna Agilent™ RP-C18 (150 mm × 4,6 mm, 5 μm).La fase mobile di metanolo e acqua (60:40, v:v) è stata utilizzata a una velocità di flusso di 1,0 mL/min.Il rivelatore UV è stato impostato a 230 nm per analizzare l'effluente della colonna e la temperatura della colonna è stata impostata a 30°C.La curva standard di CK era A = 3,0408C+3,624.L'R2 per la calibrazione era 0,998 e l'intervallo di linearità era 2,3–57,5 μg/mL.I dati sono stati ottenuti da almeno tre esperimenti separati e sono presentati come medie ± SD.Le differenze tra due gruppi sono state determinate dai test t di Student.Un valore P <0,05 è stato considerato statisticamente significativo.Caratterizzazione di micelle CK PC/DPLa dimensione delle micelle CK PC/DP disperse in acqua è stata determinata in 18,58 ± 2,65 nm con un basso indice di polidispersità (PDI = 0,196; Figura 2A).L'efficienza di caricamento di CK era 11,76% ± 1,32%.La morfologia sferica è stata osservata da TEM, con dimensioni ben distribuite (Figura 2B).Il potenziale zeta delle micelle CK PC/DP è stato registrato come -35,17 ± 2,41 mV, il che indicava che le micelle erano stabili a causa dell'elevata carica superficiale negativa (Figura 2C).Particelle comprese tra 10 e 200 nm possono passare attraverso il letto vascolare e accumularsi nella posizione del tumore.34,35 Pertanto, possiamo supporre che micelle CK PC/DP di circa 20 nm possano colpire passivamente il sito del tumore.Nel frattempo, la solubilità di CK è aumentata da 33,15 ± 3,82 a 2.215,67 ± 166,39 μg/mL dopo la costituzione della formazione di micelle miste CK (P <0,05).La solubilità è aumentata di quasi 66 volte.Le micelle CK PC/DP avevano un rilascio in vitro più lento rispetto a quello del CK libero, come mostrato nella Figura 2D.I risultati del rilascio suggeriscono che le micelle miste CK avranno un migliore assorbimento a causa di tempi di ritenzione più lunghi e tassi di rilascio inferiori.Figura 2 Dimensione delle particelle (A), immagine al microscopio elettronico a trasmissione (B), potenziale zeta (C) delle micelle miste CK e loro rilascio in vitro (D).La citotossicità delle micelle CK e CK PC/DP è stata valutata dopo l'incubazione con cellule A549 per 24 ore (Figura 3A).Come mostrato nella Figura 3A, le vitalità cellulari sono diminuite in modo dipendente dalla concentrazione.Le micelle miste hanno comportato una maggiore inibizione della crescita delle cellule A549 rispetto a CK libero.L'IC50 delle micelle miste CK e CK libere a 24 ore era rispettivamente di 18,31 e 12,15 μg/mL (P <0,05).Il sistema micellare molto probabilmente ha promosso un maggiore assorbimento di farmaci, aumentando significativamente l'effetto antitumorale.Figura 3 Effetto antitumorale delle micelle miste CK e CK alle cellule A549.Test di proliferazione cellulare (A), test di analisi del ciclo cellulare (B) e test di guarigione delle ferite (C) delle cellule A549.Nota: Verde= G1, marrone= S e blu= G2 fase in B.Arresto del ciclo cellulare nelle cellule A549Per identificare l'effetto sul ciclo cellulare nelle cellule A549, la distribuzione del ciclo cellulare è stata valutata mediante citometria a flusso.Come mostrato nella Figura 3B, abbiamo scoperto che l'inibizione della sintesi del DNA da parte di CK ha arrestato il ciclo cellulare nella fase G1, con le micelle CK PC/DP più efficaci del CK libero.La percentuale di cellule nella fase G1 è aumentata dal 31,54% ± 2,48% al 39,27% ± 4,39% dopo il trattamento con micelle CK PC/DP (P <0,05).Per confermare ulteriormente l'effetto antitumorale delle micelle CK PC/DP, è stato utilizzato un test di guarigione delle ferite.Come si vede nella Figura 3C, sia le micelle miste CK che CK hanno inibito più fortemente l'invasione delle cellule A549 rispetto a quella del controllo.Confrontando le micelle CK e CK PC/DP libere, queste ultime hanno mostrato un effetto inibitorio significativamente migliore.Pertanto, i risultati indicano che la CK può ridurre l'invasività delle cellule tumorali e l'effetto è aumentato significativamente dopo il caricamento nel sistema di rilascio di PC/DP, probabilmente a causa del miglioramento dell'assorbimento.Saggio TUNEL e apoptosi nelle cellule A549I saggi di colorazione TUNEL e annessina-V/PI sono stati utilizzati per valutare l'effetto di induzione dell'apoptosi di CK sulle cellule A549.La morfologia delle cellule A549 è stata studiata dopo incubazione con micelle miste CK o CK per 24 ore.Utilizzando TUNEL, le cellule colorate positivamente erano evidenti nei gruppi di micelle miste CK e CK, mentre le cellule colorate erano assenti nel gruppo di controllo (Figura 4A).Sono stati osservati più corpi apoptotici dopo il trattamento con micelle CK PC/DP rispetto al trattamento con CK da solo.I tassi apoptotici sono stati quantificati utilizzando un test di colorazione con annessina V/PI.Il tasso di apoptosi era più alto nel gruppo di micelle miste CK (Figura 4B).Il tasso di apoptosi tardiva è aumentato dal 6,7% al 19,8% dopo il trattamento con le micelle CK PC/DP (P <0,05).In questo studio sono state condotte analisi qualitative e quantitative per valutare l'apoptosi.I risultati sono coerenti e indicano che il sistema micellare CK PC/DP può indurre l'apoptosi con un effetto migliorato rispetto a quello del solo CK.Figura 4 I corpi apoptotici (A) e il rapporto di apoptosi (B) sono stati determinati per l'analisi qualitativa e quantitativa.Assorbimento cellulare delle micelle PC/DPLa microscopia a fluorescenza e la microscopia confocale sono state utilizzate per valutare l'assorbimento delle micelle PC/DP da parte delle cellule A549.La cumarina-6 è stata scelta come colorante fluorescente per il tracciamento.Le immagini di fluorescenza delle cellule A549 (Figura 5A e B) indicano che l'intensità di fluorescenza della cumarina-6 è maggiore quando viene fornita alle cellule A549 nelle micelle PC/DP rispetto a quando viene fornita come cumarina-6 libera.Inoltre, queste immagini suggeriscono che il sistema micellare PC/DP può aumentare l'assorbimento dei farmaci.La microscopia confocale (Figura 5B) ha indicato che il sistema micellare misto ha consegnato la cumarina-6 al citoplasma delle cellule A549.Pertanto, il sistema micellare PC/DP può trasferire facilmente i farmaci nelle cellule tumorali per potenziare l'effetto antitumorale.Figura 5 L'assorbimento (A) e la posizione (B) delle micelle PC/DP osservate nelle cellule A549.L'effetto di targeting tumorale delle micelle PC/DP ottenute in vivo (C).La Figura 5C illustra l'accumulo di DiR contro il tempo nei tumori dello xenotrapianto.Due ore dopo la somministrazione di micelle miste DiR, è stato osservato un segnale di fluorescenza nella posizione del tumore.L'intensità massima della fluorescenza si è verificata a 12 ore ed è stata mantenuta fino a 24 ore.Tuttavia, il DiR libero non ha mostrato un effetto tumorale mirato.Questo fenomeno illustra che l'effetto di targeting del tumore del sistema micellare PC/DP può trasferire farmaci nei tessuti tumorali, il che era coerente con i nostri risultati in vitro.Dopo la somministrazione di micelle miste DiR o DiR per 24 ore, il tumore e gli organi principali sono stati asportati per eseguire l'imaging ottico ex vivo.Sebbene il fegato e la milza nei gruppi di micelle miste DiR e DiR mostrassero fluorescenza, la fluorescenza nei tessuti tumorali poteva essere osservata solo nel gruppo di micelle miste DiR.Il sistema micellare PC/DP sembra localizzarsi nel sito del tumore e ciò si verifica per una durata maggiore.Pertanto, le immagini ottiche in vivo e le immagini ottiche ex vivo sono coerenti.Questi risultati indicano che il sistema micellare PC/DP può trasportare farmaci nella sede del tumore.La Figura 6 illustra l'effetto antitumorale nei tumori xenotrapianti di diverse formulazioni.I risultati dimostrano che le micelle miste CK e CK hanno inibito significativamente la crescita del tumore (P <0,05).Le micelle miste CK hanno mostrato un effetto antitumorale ottimale (52,17% ± 7,29% al giorno 15) rispetto a quello riportato per il gruppo di controllo.Figura 6 I volumi relativi del tumore (A), le immagini del tumore (B) e il peso corporeo (C) dei topi per ciascun gruppo.Solo nel gruppo di controllo portatore di tumore è stata osservata una perdita di peso corporeo, simile a quella osservata nei pazienti oncologici.C'era una diminuzione <10% del peso corporeo dei topi trattati con micelle miste CK e CK.Ciò indica l'efficacia e la sicurezza antitumorali delle micelle miste CK e CK.La sicurezza e la migliore efficacia antitumorale delle micelle miste CK nei topi nudi portatori di tumore sono state confermate dall'istopatologia, che è stata eseguita per osservare i cambiamenti microscopici nel fegato, nei reni e nel tumore mediante colorazione H&E (Figura 7A).I fegati ei reni sono stati prelevati il ​​giorno 15. Nessuna evidenza di danno patologico è stata osservata nel fegato e nei reni.Pertanto, CK e il sistema micellare misto CK possono essere utilizzati senza una significativa tossicità per il fegato e i reni.Sulla valutazione delle sezioni tumorali, è stata osservata un'apoptosi significativa nell'area interna e laterale dei tessuti tumorali per il gruppo di micelle miste CK, che era coerente con lo studio in vitro.Nel gruppo di controllo è stata osservata una lieve necrosi nell'area interna del tessuto tumorale.Figura 7 Tumore, fegato e tessuto renale colorati con ematossilina ed eosina dopo il trattamento con micelle dei topi (trattamento ogni terzo giorno per 15 giorni) (A).Espressione della proteina dell'apoptosi nei tessuti tumorali (B).Successivamente abbiamo esaminato le proteine ​​​​della famiglia Bcl-2 e le proteine ​​​​della caspasi per comprendere il meccanismo dell'apoptosi indotta in vivo.Come mostrato nella Figura 7B, abbiamo scoperto che il trattamento con micelle miste CK potrebbe aumentare significativamente il rapporto BAX/Bcl-2.Ciò ha dimostrato che la CK consegnata ai tessuti tumorali dal sistema micellare PC/DP potrebbe promuovere efficacemente l'apoptosi del tumore.Per studiare se il sistema micellare CK PC/DP potrebbe aumentare la sensibilità apoptotica delle cellule tumorali, sono state studiate l'espressione della proteina caspasi-3, caspasi-8, caspasi-9 e PARP nei tessuti tumorali.Dopo il trattamento con le micelle miste CK, l'espressione delle proteine ​​associate all'apoptosi caspasi-3, caspasi-8 e caspasi-9 è aumentata rispettivamente di 2,1, 0,9 e 0,7 volte.Nel frattempo, l'espressione PARP è aumentata di 1,8 volte.È stato osservato un aumento significativo dell'espressione della caspasi e della proteina PARP dopo il trattamento con il sistema micellare PC/DP rispetto a quello osservato con CK libero (P <0,05).Pertanto, gli studi in vitro e in vivo hanno confermato che il sistema micellare CK PC/DP può indurre efficacemente l'apoptosi.Inoltre, le micelle miste di CK mostrano una bassa tossicità tissutale e un maggiore effetto antitumorale rispetto a quello del solo CK, dovuto in particolare all'induzione dell'apoptosi.Per ottenere effetti antitumorali, la CK deve prima essere trasmessa alla sede del tumore e attraversare le membrane delle cellule tumorali per ottenere concentrazioni intracellulari efficaci.Tuttavia, la bassa solubilità, il metabolismo epatico e l'attività della glicoproteina P hanno reso difficile l'ottenimento di concentrazioni efficaci di CK nel sangue.12,13 Inoltre, a causa dell'abbondante attività della proteina di efflusso del farmaco nei tumori, la CK può non avere un sufficiente accumulo di tumore, simile a quello di altri farmaci chemioterapici convenzionali.Pertanto, per aumentare l'efficacia del trattamento del cancro della CK, è importante aumentare la sua concentrazione sierica e promuovere il suo accumulo intracellulare di CK nei tessuti tumorali.Le micelle sono strutture colloidali sferiche autoassemblanti di dimensioni inferiori a 100 nm con una distribuzione dimensionale stretta.Si formano spontaneamente in condizioni acquose per produrre un nucleo idrofobico e un guscio idrofilo36 e sono utilizzati per la somministrazione parenterale di farmaci, in particolare di farmaci a bassa solubilità (compresi i farmaci antitumorali).In generale, sono considerati un sistema di somministrazione di farmaci a lunga circolazione sicuro e biocompatibile quando ricoperti da un guscio polimerico idrofilo.37 Un certo numero di micelle polimeriche sono state considerate agenti bersaglio passivi e testate in studi clinici.38A tal fine, le micelle PC/DP sono emerse come potenziali vettori per la somministrazione di CK grazie alle loro caratteristiche interessanti, come le loro piccole dimensioni e l'elevata capacità di carico, che consentono l'accumulo di CK nel tessuto tumorale attraverso la vascolarizzazione del tumore che perde, utilizzando la maggiore permeazione e effetto di ritenzione.Inoltre, ciò potrebbe ridurre al minimo l'esposizione dei tessuti sani al farmaco.Nel presente studio, è stato dimostrato che la solubilità di CK aumenta da 33,15 ± 3,82 a 2.215,67 ± 166,39 μg/mL dopo la formazione di micelle miste di CK.La solubilità è aumentata di circa 66 volte, il che dovrebbe consentire a CK di ottenere una concentrazione ematica più elevata di quella che potrebbe ottenere come farmaco libero.Inoltre, le micelle miste PC/DP hanno effettivamente mantenuto il CK caricato nei loro nuclei idrofobici in un ambiente fisiologico simulato.Dopo l'incapsulamento nelle micelle, CK ha mostrato un comportamento a rilascio prolungato in vitro.Inoltre, l'imaging in vivo ha indicato che le micelle miste PC/DP avevano un lungo tempo di ritenzione dopo l'iniezione.Inoltre, il PEG rivestito sulla superficie delle micelle miste potrebbe ostacolare stericamente l'interazione con le proteine ​​plasmatiche,39 eludere l'inghiottimento dei macrofagi nel sistema reticoloendoteliale,40 consentire lo stravaso attraverso l'endotelio tumorale,41,42 e colpire passivamente il sito del tumore attraverso la maggiore permeazione e effetto di ritenzione.Ciò è stato dimostrato nelle sezioni "Caratterizzazione delle micelle CK PC/DP" e "Imaging ottico in vivo".Il PEG è ampiamente utilizzato come materia prima idrofila per le micelle (peso molecolare 2–15 kDa) grazie alla sua elevata solubilità in acqua, non tossicità e carica neutra.La corona idrofila formata da PEG sulla superficie delle micelle diminuisce l'interazione aspecifica con le proteine ​​del sangue, aumentando così il tempo di circolazione.È importante sottolineare che, attraverso esperimenti antitumorali in vivo, gli effetti terapeutici sono stati valutati in base alle variazioni di volume del tumore alla fine del trattamento.Le micelle miste di CK hanno determinato una maggiore inibizione del tumore rispetto alla CK libera.Ciò era dovuto al fatto che le micelle miste di CK aumentavano significativamente la concentrazione di CK nei tessuti tumorali attraverso l'aumento della permeabilità e dell'effetto di ritenzione, che era stato precedentemente convalidato dall'imaging ottico in vivo.CK Le micelle PC/DP possono migliorare significativamente l'efficacia del trattamento del cancro del polmone in vitro e in vivo della CK.Sia PC che DP sono eccipienti farmaceutici approvati dalla Food and Drug Administration statunitense, il che rende l'attuale sistema di somministrazione micellare altamente traducibile nella clinica.Tuttavia, sono necessari studi futuri per stabilire l'efficacia di questo sistema di somministrazione in ambito clinico.Le micelle miste CK hanno mostrato i più forti effetti proapoptotici e l'efficacia antitumorale contro le cellule A549, che possono essere dovute all'aumento dell'assorbimento cellulare e al potenziamento del targeting tumorale da parte delle micelle miste CK.Questi risultati indicano che il sistema di rilascio di micelle miste PC DSPE PEG 2000 promette molto di essere utilizzato con CK nelle terapie contro il cancro mirate.Questo lavoro è stato supportato dal progetto della Jiangsu Natural Science Foundation of China (concessione n. BK20171321), Jiangsu Youth Medical Talents Project (concessione n. QNRC2016482), National Natural Science Foundation of China (concessione n. 81503265) e il progetto di supporto per la scienza e la tecnologia di Suqian (n. di sovvenzione S201622 e S201623).Gli autori non segnalano conflitti di interesse in questo lavoro.Yosioka I, Sugawara T, Imai K, Kitagawa I. Idrolisi batterica del suolo che porta al vero aglicone.V. Sui ginsenosidi Rbl, Rb2 e Rc delle saponine della radice di ginseng.Chem Pharm Bull (Tokyo).1972;20(11):2418–2421.Hasegawa H, Sung JH, Matsumiya S, Uchiyama M. Principali metaboliti della saponina del ginseng formati da batteri intestinali.Pianta Med.1996;62(5):453–457.Akao T, Kida H, Kanaoka M, Hattori M, Kobashi K. L'idrolisi batterica intestinale è necessaria per la comparsa del composto K nel plasma di ratto dopo la somministrazione orale di ginsenoside Rb1 da Panax ginseng.J Pharmacol.1998;50(10):1155–1160.Man S, Gao W, Zhang Y, Huang L, Liu C. 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